Obrazowanie mikroskopowe

Co to jest mikroskop?

Słowo "mikroskop" pochodzi od połączenia greckich słów: μικρός (mikrós), oznaczającego „mały”, oraz σκοπεῖν (skopeîn), oznaczającego „obraz”, i jest nazwą urządzenia laboratoryjnego używanego do oglądania obiektów żywych i nieżywych, które są zbyt małe, aby zobaczyć je gołym okiem, oraz szczegółów tych obiektów przy użyciu różnych systemów optycznych. Ponieważ ludzkie oko jest w stanie dostrzegać obiekty większe niż 200-250 μm, konieczne jest użycie mikroskopu do badania mniejszych obiektów.

Najważniejszą częścią nowoczesnego mikroskopu, który składa się z wielu elementów, są soczewki. Soczewki służą do powiększania obrazu obiektów i obserwowania ich szczegółów. Gdy światło dociera do oka ludzkiego przechodząc przez soczewki wypukłe zgodnie z właściwościami odbicia, załamania, transmisji, absorpcji, dyfrakcji i indukcji fluorescencji badanego obiektu, sprawia, że obiekt ten wydaje się większy niż w rzeczywistości. W XVII wieku Holender Anton van Leeuwenhoek i Anglik Robert Hooke opracowali podstawowe zasady dzisiejszego mikroskopu, a w ciągu historii innowacje technologiczne uczyniły mikroskop łatwiejszym w użyciu i poprawiły jakość uzyskiwanych obrazów.

W mikroskopii termin "rozdzielczość" służy do opisania zdolności mikroskopu do rozróżniania detali. Innymi słowy, jest to minimalna odległość, przy której dwa różne punkty próbki mogą być widziane (zarówno przez obserwatora, jak i przez kamerę mikroskopu) jako oddzielne byty.

Mikroskopy dzielą się na dwie główne grupy w zależności od używanego toru świetlnego:

Mikroskopy złożone 

Są współczesnym rozwinięciem powiększaczy znanych jako mikroskopy proste, które składają się z pojedynczego toru świetlnego. Nazywane są również mikroskopami świetlnymi. Oferują one szerszy zakres powiększenia i dwuwymiarowe obrazowanie. W zależności od obiektywów w standardowym mikroskopie świetlnym, zapewniają powiększenie w zakresie od 4x do 100x. Po dodaniu okularu o powiększeniu 10x do urządzenia, całkowite powiększenie wzrasta do 1000x. Takie powiększenie jest niezbędne do obrazowania cienkich sekcji roślin i tkanek, krwi i komórek nabłonkowych, bakterii i pyłków.

Istnieją dwa rodzaje mikroskopów świetlnych w zależności od umiejscowienia ich obiektywów: mikroskopy świetlne prostego i odwróconego układu. Wybór umiejscowienia obiektywów należy dobrać w zależności od przejrzystości światła i rozmiaru próbki, którą należy zbadać w mikroskopie. Mikroskopy świetlne o układzie prostym są odpowiednie do obrazowania próbek przepuszczających światło, żywych i martwych, przygotowanych między szkiełkami i nakrywek. W mikroskopach świetlnych o układzie odwróconym obiektywy umieszczone są pod stolikiem i są preferowane do badań takich jak mikroskopia hodowli komórkowej w szalkach Petriego lub kolbach.

Mikroskopy stereoskopowe 

Składają się z dwóch identycznych soczewek i połączonej ścieżki światła, a ich użycie pozwala na obrazowanie obiektów w trzech wymiarach. Mogą być używane do mniejszych powiększeń niż mikroskopy świetlne, ale są przede wszystkim preferowane do badania próbek różnych rozmiarów bez konieczności specjalnego przygotowania. Są szczególnie odpowiednie do sekcji, obróbki ręcznej, produkcji i kontroli jakości.

Różne typy tych dwóch rodzajów mikroskopów mogą być wybierane i używane w zależności od wykonywanych zastosowań i charakterystyki badanej próbki. Dzięki systemom kamerowym dołączanym do mikroskopów możliwe jest udostępnianie, archiwizowanie i przetwarzanie obrazu przeniesionego z pola optycznego do środowiska cyfrowego. Możliwość pomiaru i analizy zgodnie z normami na obrazach pozwala na stosowanie mikroskopów w wielu sektorach.

Drugim ważnym elementem potrzebnym do uzyskania obrazów za pomocą mikroskopu jest światło. Różne próbki obrazowane są przy użyciu różnych metod oświetleniowych:

Mikroskopia pola jasnego

Jest klasyczną techniką obrazowania w mikroskopii świetlnej. Promień świetlny pochodzący ze źródła światła oświetla próbkę, a obraz powstaje dzięki odbitemu światłu. Techniką tą można obrazować próbki o wysokim kontraście. Próbki do badania można poprawić pod względem widoczności, barwiąc je specjalnymi barwnikami.

Mikroskopia pola ciemnego

Jest alternatywną metodą oświetlenia dla próbek, które nie mają wysokiego kontrastu, są stosunkowo przezroczyste i nie mogą być barwione. W tej metodzie światło nie dociera bezpośrednio do soczewki, a ciemne pole jest tworzone za pomocą używanych filtrów. Próbka umieszczona przed światłem, nawet jeśli jest przezroczysta, jest wyraźnie widoczna na ciemnym tle.

Mikroskopia kontrastu fazowego

Służy do obrazowania próbek, korzystając z różnic fazowych, gęstości i grubości w ich strukturze. Można je podzielić na kontrast fazowy dla cienkich sekcji i różnicowy kontrast interferencyjny dla grubszych sekcji. W obu technikach różnice fazowe w próbce są ujawniane dzięki specjalnym filtrom dodanym przed kondensatorem, a próbka jest obrazowana bez konieczności barwienia.

Mikroskopia polaryzacyjna 

Jest zasadą obrazowania badanych próbek, korzystając z ich optycznych właściwości anizotropowych. Została opracowana na podstawie odpowiedzi próbki na światło spolaryzowane. Nadaje się do badań na żywo i jest często używana w analizach minerałów i materiałów.

Mikroskopia fluorescencyjna 

Opiera się na zasadzie obrazowania światła o określonej długości fali odbijanego od próbki. Używane są barwniki fluorescencyjne, które wiążą się ze specyficznymi obszarami próbki (na przykład błoną komórkową, białkami, makrocząsteczkami w komórkach żywych). Te barwniki, ekscytowane światłem o określonej długości fali, emitują światło o innej długości fali. W mikroskopach fluorescencyjnych używane są specjalne filtry, które przepuszczają tylko tę określoną długość fali światła do oka lub kamery. W ten sposób obrazowany jest obszar przyłączony do próbki i emitujący światło. Mikroskopia fluorescencyjna jest techniką, którą można stosować w mikroskopach stereo, prostych lub odwróconych.

Mikroskopia konfokalna 

Jest połączeniem klasycznej techniki mikroskopii fluorescencyjnej z komponentami cyfrowymi. Próbka jest ekscytowana tylko długością fali światła, którą barwnik fluorescencyjny przyłączony do niej pochłonie, i jest obrazowana za pomocą detektora, który rejestruje długość fali światła, którą barwnik wyemituje. W przeciwieństwie do klasycznej mikroskopii fluorescencyjnej, detektory rejestrują różne promieniowania z różnych głębokości próbki, umożliwiając tworzenie obrazów 3D. Ponieważ stosowana technika nie uszkadza badanej próbki, jest szczególnie preferowana w obrazowaniu komórek żywych.

Zastosowania mikroskopów:

Badania naukowe:

Badania nad rakiem

Biologia komórkowa – Obrazowanie komórek żywych

Hodowla komórkowa

Mikrodyssekcja laserowa – Mikromanipulacja