Ilościowa technika PCR

PCR w czasie rzeczywistym (znana również jako real-time PCR, qPCR lub ilościowa reakcja PCR) jest techniką biologii molekularnej używaną do szybkiego i precyzyjnego pomiaru ilości DNA lub RNA. Metoda ta stale monitoruje proces amplifikacji PCR i jest stosowana w wielu obszarach, takich jak analiza ekspresji genów, warianty genetyczne i detekcja patogenów.

Kluczowe cechy Real-Time PCR:

Analiza ilościowa: Real-Time PCR mierzy ilość docelowego DNA lub RNA w czasie rzeczywistym. Umożliwia to dokładne określenie i monitorowanie początkowej ilości materiału genetycznego.

Monitorowanie dynamiczne: PCR monitoruje sygnały fluorescencyjne przez cały proces amplifikacji. Sygnały te wzrastają wraz z replikacją DNA i są używane do pomiaru poziomów ekspresji genów lub ilości materiału genetycznego.

Wysoka czułość i dokładność: qPCR może mierzyć ilość materiału genetycznego z dużą czułością i skutecznie wykrywać niskie liczby kopii lub małe zmiany.

Proces Real-Time PCR:

Przygotowanie Próbki: Próbki DNA lub RNA są przygotowywane do amplifikacji i analizy. Jeśli analizowane jest RNA, może być konieczne przekształcenie RNA na cDNA (odwrotna transkrypcja).

Mieszanina reakcyjna: Do mieszaniny reakcyjnej PCR dodawane są startery specyficzne dla docelowego DNA, znaczniki fluorescencyjne (sondy) oraz polimeraza DNA. Znaczniki generują sygnał fluorescencyjny podczas amplifikacji.

Amplifikacja i monitorowanie: Urządzenie PCR monitoruje proces amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym. W każdym cyklu PCR sygnał fluorescencyjny wzrasta, a wzrost ten jest mierzony w celu określenia ilości DNA.

Znaczniki używane w Real-Time PCR:

SYBR Green: Ogólny barwnik fluorescencyjny wiążący DNA. Generuje sygnał fluorescencyjny w każdej kopii DNA.

Sondy TaqMan: Znaczniki specyficzne dla określonych sekwencji DNA. Generują sygnał poprzez wiązanie z docelową sekwencją DNA.

Analiza wyników: Urządzenie PCR analizuje sygnały fluorescencyjne i krzywe amplifikacji. Dane te są używane do określenia poziomów ekspresji genów, wariantów genetycznych lub ilości docelowego DNA. Zazwyczaj dane dotyczące ekspresji genów są normalizowane do genów referencyjnych (kontrolnych).

Zastosowania Real-Time PCR:

Analiza ekspresji genów: Używana do mierzenia, jak bardzo określone geny są wyrażane. Jest to ważne dla oceny odpowiedzi komórkowych, mechanizmów chorobowych i efektów leczenia.

Detekcja wariantów genetycznych: Stosowana do analizy SNP (polimorfizmów pojedynczych nukleotydów) i innych zmian genetycznych.

Detekcja patogenów: Używana do detekcji i kwantyfikacji bakterii, wirusów i innych patogenów. Jest szczególnie powszechna w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych.

Diagnostyka i monitorowanie chorób: Używana do diagnozowania chorób genetycznych, monitorowania odpowiedzi na leczenie i oceny postępu choroby.

Analiza środowiskowa i żywności: Używana do identyfikacji i monitorowania kontaminacji mikrobiologicznej w próbkach środowiskowych i produktach spożywczych.

Real-Time PCR jest ważnym narzędziem w badaniach genetycznych i biologii molekularnej, umożliwiającym wrażliwe i dokładne pomiary w wielu różnych dziedzinach.